(C/N:CE604)

---湖南中檢維康生物技術(shù)有限公司

1．概要

軟骨藻酸（Domoic acid，DA）是一種天然神經(jīng)性氨基酸，要由某些擬菱形藻屬和菱形藻屬的海洋硅藻產(chǎn)生，人們食用毒化的貝類，可引起記憶喪失、眩暈、昏迷甚至死亡等癥狀，根據(jù)這種毒素的中毒特征，被命名為記憶喪失性貝毒（Amnesic Shellfish Poisoning，ASP）。研究發(fā)現(xiàn)，貝組織中軟骨藻酸含量達(dá)到40mg／kg時(shí)可引起食用者中毒，150mg／kg 時(shí)有致死危險(xiǎn)，人類通過進(jìn)食可耐受的最大為20mg/kg。

2．原理

本試劑盒采用間接競爭法。酶標(biāo)板微孔中預(yù)包被軟骨藻酸毒素抗原，樣品中殘留的軟骨藻酸毒素與微孔板上的抗原競爭軟骨藻酸毒素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB顯色，吸光值與樣品中軟骨藻酸毒素含量成負(fù)相關(guān)。

3．試劑盒組成

1）包被有抗原的96微孔板：1塊（96孔，12條×8孔）

2）標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0、0.3、1.0、3.0、9.0ng/mL        1瓶x1mL

3）軟骨藻酸毒素抗體：        1瓶x8mL

4）酶標(biāo)二抗：        1瓶x15mL

5)        10x濃縮洗滌液：        1瓶x50mL

6）樣本希釋夜：        2瓶×50mL

7）顯色底物液（TMB）：        1瓶×17mL

8）終止液：        1瓶×7mL

9）試劑盒說明書

10）質(zhì)檢報(bào)告

4．需要的儀器、試劑

1）儀器

酶標(biāo)儀450nm（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）

離心機(jī)

微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL

-50mL離心管、8道微量移液器酶標(biāo)板振蕩器 

天平：感量0.01g

2）試劑

去離子水

甲醇

5．樣品處理

5.1貝類樣本

1）去除貝殼取出貝肉，將貝肉樣本均質(zhì)；

2）稱取1.0g均質(zhì)好的樣本于10mL離心管中；

3）加入4mL50％甲醇水，劇烈震蕩5min；

4）室溫4000r／min離心10分鐘；

5）取上清液20μL到980μL樣本希釋夜中，混勻；

6）取50μL混勻液用于檢測。

稀釋倍數(shù)：200

6．酶聯(lián)免疫分析程序

6.1測定之前注意事項(xiàng)

1）使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。

2）使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。

3）在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

4）所有孵育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。

6.2 溶液的配制

1）洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍后使用（1份濃縮洗滌液加9去份離子水）。

2） 50％甲醇水的配制：量取50mL甲醇加入50mL 去離子水。

6.3測定程序

1）將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。

2）分別吸取50μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL軟骨藻酸毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。

3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時(shí)每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。

4）加入100μL酶標(biāo)二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。

5）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時(shí)每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。

6）每孔加入100μL底物，室溫避光溫育10分鐘。

7）每孔加入50μL終止液，混勻。

8）置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7．結(jié)果判定

1）所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（0標(biāo)）的吸光度值（Bo）再乘以100％，即百分吸光度值。百分吸光度值

以軟骨藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。

2）樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。 

3）如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。

8．注意事項(xiàng)

1）室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。

2）在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。

4）混合要均勻，洗板要充分（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。

5）反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。

6）不要使用過期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會(huì)引起靈敏度降低。 

7）試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。

9．檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、交叉反應(yīng)率

1）精密度：批內(nèi)變異系數(shù)＜10％(n=10)

批間變異系數(shù)＜25％（n＝10）

2）靈敏度：0.3ng／mL。

3）樣本檢測線：

貝類        60ng/mL

4）準(zhǔn)確度：

貝類        90%±25%

5）交叉反應(yīng)率：

軟骨藻酸        100%